CAMPO - INFORMAZIONE
La riunione di oggi nel locale prospicente il lago di Lugano è dedicata ad una esperienza vissuta in prima persona.
L’obiettivo è ripercorrere il viaggio di quello che internamente abbiamo chiamato: cellule inattivate, con diversi marchi, bioattività, microbiota. Viene svolto nelle attività R&D da Certifeed 2021 ed è riservato a coloro che collaborano in e con Doxal, per una
propria formazione, relativamente alla scoperta, agli ambiti di applicazione ed alle attività R&D che discendono.
Come base del ripercorso immagino la partenza di Colombo con le tre caravelle da Palos. Perché anche Colombo aveva poche certezze e le idee non gli si sono schiarite del tutto. Solamente al terzo viaggio, pur essendo Viceré della Spagna, si rese conto, e lo scrisse nel proprio diario, che non erano le Indie ma che aveva scoperto un nuovo continente.
Era il 1980 e con il dr. Grabitz eravamo impegnati su diversi fronti: a produrre dei prodotti liquidi che risultavano i migliori del mercato, a fare delle diluizioni di medicati e di nutrizionali, a trovare qualcosa che fosse originario per Doxal e portasse dei vantaggi ai nostri clienti che allevavano degli organismi viventi, degli animali. Ho scritto scoperta, ma facendo il ripercorso ridimensiono e dico la scoperta dell’ovvio. Tutto infatti era sul tavolo, ma vederlo non era così facile.
Iniziamo da due considerazioni:
[1] Si consiglia: Wikipedia: Il rapporto microbiota intestinale e la fragilità nell’anziano.
[2] Wikipedia: Escherichia Coli: Biologia e Infezioni da Escherichia Coli.
Ora andiamo a vedere, con calma, cosa c’era e cosa c’è sul tavolo. Quello che riferiamo era ed è noto a tutti coloro che sono interessati all’argomento. E’ un modo di approcciare per chiunque voglia allestire, in ogni momento, delle caravelle, per un percorso che comprenda la ricerca fondamentale, la ricerca industriale e lo sviluppo sperimentale.
Non è una attività facile. Ci vuole molta pazienza, ordine e pulizia, qualità che normalmente contraddistinguono le risorse che operano nei Laboratori di analisi. Qualsiasi Lattobacillo normalmente viene conservato, liofilizzato, in freezer. La riattivazione avviene in una beuta [fialetta], aggiungendo del MRS brodo[1] [che contiene Estratto di lievito > 4%], agitando delicatamente e lasciandolo per una notte a 37°C. Al mattino è sveglio, ma, come ognuno di noi, con poche idee e poca voglia di attivarsi.
Ma al mattino possiamo metterlo al lavoro.
[1] Biolife scheda tecnica APT Agar e APT Broth
Normalmente nel nostro Laboratorio prepariamo delle scatole Petri in cui viene messo MRS Agar, solido, sul fondo, che contiene il Lattobacillus Acidophilus nella diluizione di 10-7, perché a diluizioni maggiori si avrebbero delle difficoltà nella conta.
L’MRS Agar, solido, viene preparato nel nostro Laboratorio senza aggiungere l’estratto di lievito mentre tutti gli MRS Agar solidi, utilizzati dai differenti Laboratori di Microbiologia lo contengono.
La foto evidenzia la crescita del Lattobacillus Acidophilus, rappresentato da un punto che rappresenta una colonia.
Questa è appunto l’osservazione che facemmo il dr. Grabitz e io. Ed è importante.
La foto rappresenta una scatola Petri che contiene Cellule di lievito vivo 10-3, e a cui è stato aggiunto Lactobacillus Acidophilus in varie concentrazioni: 10-7, 10-5, 10-3.
Le cellule di lievito vivo occupano tutto lo spazio e tendono a far scomparire l’intero MSR Agar, e di Lactobacillus Acidophilus nemmeno l’ombra!
A questo punto, Grabitz e io, vediamo un obiettivo: dobbiamo ottenere che le cellule di lievito vivo siano inattivate, non vivano più, ma conservino le loro caratteristiche: termo, antibiotico ed acido resistenza.
Infatti le cellule di lievito vivo utilizzano zuccheri ed aminoacidi che trovano dovunque e soprattutto negli apporti che riceve un organismo (quindi è una sottrazione), e producono alcool e CO2, che sono dannosi per l’organismo (quindi è un danno). Il fatto è che la produttività di ogni tipo di lievito è altissima ed ogni cellula è caratterizzata da una particolare forza: è acido gastro termo e antibiotico resistente!
Qui dobbiamo fermarci per fare alcune considerazioni di base. Per noi, il dr. Grabitz ed io, il lievito vivo non è un simbionte. E’ un commensale che può divenire patogeno. Ma lo usano e si trovano bene? Ma viene venduto in tutto il mondo e da ditte grandi. E allora? Niente da dire. Ma per noi resta un commensale che può divenire patogeno. Cito due esempi
E. coli è l’abbreviazione utilizzata per identificare l’Escherichia coli, batterio molto diffuso e non sempre “pericoloso” per l’uomo. Nella maggior parte dei casi, questo microrganismo vive da commensale, senza causare danni, talvolta collaborando alle funzioni fisiologiche dell’organismo ospite. Esistono, però, alcune tipologie di E. coliche possiedono una patogenicità tale da poter causare malattie anche molto gravi, come enteriti, colite emorragica, infezioni urinarie, meningite e setticemia.
Clostridium botulinum, che dà origine alla tossina botulino che è uno dei veleni tra i più dannosi presenti in natura. E viene utilizzata in chirurgia estetica.
Una metodologia per inattivare la cellule senza romperla. Se non fosse inattivata è un potenziale patogeno, non muore e non morirà nell’organismo, se la rompessimo perderemmo le caratteristiche di termo, antibiotico ed acido resistenza. Mica facile!
E lo trovammo, anche se superando alcune difficoltà.
Questa è la foto che mostra le cellule inattivate 10-3, sia in forma liquida che spray dry [ma su questo ci torniamo più avanti] con il Lactobacillus Acidophilis 10-7. Era vero! Le cellule inattivate favorivano la crescita del Lactobacillus Acidophilus, il confronto con e senza cellule inattivate è palese. Ma era vero che il lievito inattivato non impediva la crescita dei simbionti come invece avviene con il lievito vivo. Ecco perché non lo aggiunge nell’Agar delle scatole Petri.
Questo è un momento di chiarezza e di riflessione. La nostra perplessità nell’impiego del lievito vivo per dei trattamenti di somministrazione su di un organismo ci lascia perplessi.
La patogenicità è nota e la sua capacità di dare vita a delle varianti, adattandosi all’ambiente ed ad altro, rende quanto meno dubbio l’impiego.
Ma, mi dite e ridite, “lo si impiega!”. Vi rispondo che si impiega anche il botulino, un batterio il Clostridium Botulinum che produce una tossina che è uno dei veleni tra i più pericolosi. Eppure lo si impiega in estetica ed anche in alimentazione. Ma, credo, con estrema prudenza. Questa estrema prudenza è la nostra perplessità.
In effetti il Prof. Cirilli ci mostrò, fiero di sé, la foto in cui vengono ripresi dei Lattobacilli che banchettano intorno ad una cellula inattivata. Che pazienza e che costanza ha avuto il prof. Cirilli per immortalare il momento!
Ma sapevamo dove eravamo arrivati?
Per noi erano ancora le Indie. Eravamo infatti come Cristoforo Colombo che dopo due viaggi di andata e ritorno non aveva ancora scoperto, pur essendo vicerè, che le terre che aveva scoperto fossero un nuovo continente.
Avendo notato in ogni cultura effettuata che vi era una maggior crescita dei simbionti, in particolare fermenti lattici, eravamo persuasi che anche in vivo, grazie alle immutate caratteristiche della cellule inattivata (gastro, acido, termo ed antibiotico resistenza), questa avrebbe raggiunto il luogo di ritrovo della flora e degli apporti, per svolgere le stesse funzioni che l’estratto di lievito svolgeva nelle scatole Petri. La nostra persuasione avrebbe dovuto portare dei benefici sia sanitari che nutrizionali. Per quanto riguarda i benefici sanitari eravamo persuasi, anche se eravamo molto curiosi in merito alle modalità di controllo, di ottenere dei benefici nella maggior efficienza epatica, nella maggior resistenza alle malattie ed alla diminuzione di problemi nelle fasi critiche, come evidenziato nella diapositiva.
I test di campi furono diversi e sulle diverse specie animali e tutti avevano un riscontro positivo. Per quanto riguarda i benefici nutrizionali la maggior attività dei simbionti avrebbe portato ad un maggior utilizzo degli apporti (dell’alimento) e da uno sviluppo più armonico. Furono diversi i Tecnici che collaborarono con noi ma intorno a noi vi era un mondo antibiotico centrico. E per mondo non intendo solo una spazio ma tutte le risorse che operavano nel nostro settore: l’antibiotico era dovunque e sempre. Basti solo l’osservazione storica che il prodotto più venduto in assoluto erano i famosi UGF (Unknown Growth Factor), dei miceli di ogni tipo di fermentazione, ed in Italia vi erano più impianti di fermentazione di antibiotici di qualsiasi altro paese del mondo.
Anche Doxal svolgeva delle attività di promozione e vendita di sostanze antibiotiche, ma questo non ci impedì di avere l’interesse di andare a vedere con un altro posizionamento.
Anche se pochi ci ascoltavano, noi abbiamo continuato a cercare, e continuiamo ancora. La diapositiva riporta i differenti brevetti relativi a questo nostro viaggio. Consiglio vivamente chiunque sia interessato a questa attività di andare direttamente sul sito dell’European Patent Office (ESPACENET) e cercare per nominativo i brevetti che lo coinvolgono. Eravamo convinti che avevamo fatto una cosa ovviamente intelligente che bisognava solamente osservare attentamente per vederla.
La diapositiva riporta uno dei diversi test eseguiti, riguarda i risultati a dose differenti di cellule inattivate (Thepax® è uno dei marchi con i quali venivano contraddistinte le cellule inattivate, in tempi e territori differenti sono stati utilizzati altri marchi, sto andando a memoria, Biophil, Biodox, LCS, Biodoxaline, Levurene, Levitan, Celimun). A dosi differenti vi erano dei risultati positivi sulla funzionalità epatica. Sono dei test di campo, questo in particolare si svolgeva nel territorio della Provincia di Treviso dove, come Direttore dell’Istituto Zooprofilattico, svolgeva le proprie attività operative il dr. Licinio Buratto, Medico Veterinario profondo conoscitore delle malattie degli animali [attività antibiotica] in quanto, in quel tempo, la provincia di Treviso aveva la consistenza maggiore per quanto riguarda molte specie animali (polli da carne e da uova, tacchini, faraone, conigli, vitelli da latte, acquacoltura).
Viene riportato dalla diapositiva uno dei differenti test effettuati, a dosaggi differenti, in contrapposizione agli antibiotici auxinici (Flavomicina, Virginiomicina, Zinco Bacitracina, Nitrovin, ad esempio). I risultati erano simili e spesso anche migliori. Ma ci sentivamo ripetere: ”Sì, il risultato c’è ma se per caso, per qualsiasi motivo l’allevatore non è contento ed ha qualcosa da dire, noi con gli antibiotici possiamo dimostrargli, con una analisi, che noi non abbiamo alcuna responsabilità, ma con le vostre cellule che prova possiamo dare una volta che si trovano nel mangime? Non avete una metodologia analitica.”. E noi a ripetere: “Si, ma con gli antibiotici auxinici l’organismo sviluppa sempre più batteri commensali e/o patogeni più forti e questo è un danno per la salute dell’organismo.”.
Le cellule dei batteri della flora erano ritenute[1] dei semplici sacchi enzimatici, senza alcuna organizzazione. La flora batterica intestinale veniva considerata solo dal punto di vista di tenerla controllata con gli antibiotici. Inutile meravigliarsi: oggi il microbiota è sotto la lente di ingrandimento, tutto o quasi tutte le funzioni dell’organismo passano attraverso il buon funzionamento del microbiota. E’ facile oggi dire che Cristoforo Colombo aveva scoperto l’America, ma lui non se ne rese mai conto e solo al terzo ed ultimo viaggio, scrisse che forse aveva scoperto un nuovo continente. Con la conoscenza, ancorché del tutto imperfetta odierna, non dovete deridere la nostra non consapevolezza di quel tempo. Ma, secondo me, dovete riconoscere che avemmo del coraggio e della 
lungimiranza nel voler conoscere di più, nel porci delle domande sugli effetti positivi per l’organismo che dovevano avere i simbionti, anche se non venivano presi in considerazione da nessuno. Non c’era una Università, oppure organizzazione tecnica, che non fosse antibiotico centrica.
[1] P. Henry – La Mécanique du vivant
A chi potevamo rivolgerci? Il dr. Grabitz contattò il proprio mentore, il Prof. Randolph Riemschneider che operava in diverse Università, e all’Università Libera di Berlino. Parlammo con lui facendogli vedere alcuni risultati e mettendo in evidenza la nostra poca conoscenza. Il Prof. Riemschneider ci ascoltò, fece delle osservazioni dei nostri test definendole episodiche. “In pratica volete sapere se le vostre cellule inattivate funzionano sull’organismo e, in caso positivo, perché e come. E così?” Era così. Il Prof. Riemschneider ci disse che era molto occupato, che per capire quanto volevamo conoscere si doveva operare con un modello sperimentale che escludesse il più variabili possibili e che potesse valere per ogni organismo. Lui lavorava, a Berlino, in un Laboratorio dove aveva in corso diversi test embriologici ed operava con lo Xenopus Laevis Daudin per diversi motivi:
Questo è quanto riportato dal sito consultato in Internet nel 2021:
xenopus laevis daudin articolo.txt – Xenopus laevis (rospo africano, anfibî)
Con il termine sviluppo si intendono[3][4]:
Il termine inteso come branca specifica venne coniato da Paul Weiss e Norman Berrill in uno scambio di lettere in cui si chiedevano come denominare la scienza che contenesse sia l’embriologia sia l’attività dei geni, la rigenerazione, i movimenti cellulari, ecc.[5]
La biologia dello sviluppo usa metodi di biologia cellulare (citologia), genetica, biologia molecolare, biochimica e microscopia, e studia soprattutto alcuni organismi chiamati organismi modello. Un’idea fondante la biologia dello sviluppo è infatti che i processi di sviluppo siano governati da principi generali comuni, anche se questi possono non essere tutti rappresentati in un solo organismo[5]. Perciò i biologi dello sviluppo utilizzano quegli organismi che meglio illustrano principi comuni: si tratta di un numero relativamente piccolo di animali o di piante, scelti perché convenienti da studiare e adatti alla manipolazione sperimentale e/o all’analisi genetica. Gli organismi modello sono facili da riprodurre, manipolare e osservare durante lo sviluppo. Per esempio C. Elegans (nematode), il riccio di mare, il moscerino della frutta, il pesce zebra, il rospo africano e il topo; per le piante, Arabidopsis thaliana.
Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Edited by P. D. NIEUWKOOP and J. FABER. (Pp. 252; 10 plates ; 80s.) Amsterdam : North-Holland Publishing Company. 1967.
Xenopus laevis is now probably the most widely used source of amphibian eggs for experimental embryologists. The animal’s popularity is based mainly upon its prompt production of eggs on stimulation with gonadotrophic hormones, but also its hardiness and ease to rear in captivity. This book, which provides a comprehensive and authoritative account of the norma) development of this animal, will therefore be of great value to experimental embryologists.
The account of the development of Xenopus laevis is divided into three major sections which in turn are divided into subsidiary sections. The major sections dea) with, first, early development up to stage 15 (early neural-fold stage), then the development of organ complexes and finally the development of the individual) organ systems.
The section on early development up to stage 15 is detailed and thorough, but may prove difficult for some to follow. It would have been improved by devoting a little space to definition of terms and by providing one or two diagrams of histological material). In an account as comprehensive as this, they would not have been out of piace.
The sections on development of organ complexes and on development of individual organ systems are excellent and provide a valuable source of reference for the timing of various events. Again it would have been desirable to have some diagrams of the various stages of development of internal organs and of histological material).
A useful section summarizing the external and internal features at various stages in development is provided near the end of the book and this correlates very well with the series of drawings of external appearance of the animal at each stage.
Other features of the book which deserve mention are a section on how to keep Xenopus and induce ovulation and another comparing its development stages with those of other amphibia.
The book is sensibly bound in a plastic cover ideally suited to regular use in a laboratory. The price for such a work of reference is very reasonable.
It is a book which should be considered indispensable in any laboratory in which experimental embryology is in progress.
D. TARIN
Il prof. Riemschneider ci convinse, qualsiasi altro modello sperimentale sarebbe stato una perdita di tempo e non avremmo avuto dei risultati certi. Non sapeva assolutamente quali risultati ci sarebbero stati. Diedi luce verde. Ancora oggi, quando ricordo quel periodo mi sento dire “Ma a chi può interessare un test sull’allevamento delle rane?”. Quando poca profondità! Quanta superficialità! Quanta poca considerazione sulla nostra difficoltà di avere delle certezze! Ne Grabitz ne io pensavamo di fare delle esperienze sulle rane. Avevamo la necessità di capire e l’unico mezzo era rivolgerci a qualcuno seriamente preparato ad andare a fondo con un alto profilo scientifico.
Le nostre perplessità erano il campo del Prof. Riemschneider. Si fece spiegare il metodo di preparazione delle cellule inattivate, lo volle ripetere di persona nel Laboratorio, prese una quantità e se ne partì per Berlino. Dopo tre giorni ci disse che i pre test erano andati male (i girini erano tutti morti e nel giro di pochi minuti) e la causa era la sostanza che in microdosaggio utilizzavamo quale stabilizzante (si era portato oltreché le 
cellule inattivate anche ogni singola sostanza utilizzata durante il processo)! Ci disse di cambiare stabilizzante indicandoci lo stabilizzante, secondo lui, efficace.
Non vi era un altro modello sperimentale che desse tutte le risposte che avremmo avuto dalla ricerca scientifica dei Laboratori del Prof. Riemschneider a Berlino. La diapositiva riporta i parametri del modello scientifico. E i parametri valevano per qualsiasi altro organismo vivente. E’ stata una scelta felice. Anche se ancora non avevamo delle certezze e non sapevamo l’esito del test che ci veniva proposto. Osserviamo ogni parametro e confrontiamolo con lo sviluppo embrionale di qualsiasi altro organismo. Per ogni parametro molto probabilmente entrano in funzione diverse sostanze elaborate anche dal microbiota. Ed alcuni parametri debbono essere preparati, messi lentamente in esecuzione, al fine di non produrre anomalie, di favorire un armonico sviluppo. Sappiamo davvero tutto su quanto serve per i singoli parametri? Sappiamo cosa e come deve intervenire il microbiota o gli elementi elaborati dallo stesso per essere messi in grado di venire utilizzati dall’organismo? Vi sono dei ricercatori che lavorano sui singoli parametri per identificare i meccanismi d’azione, anche se oggi il clima è molto differente. I problemi dell’organogenesi e lo sviluppo precoce hanno incitato molti nuovi scientifici ad entrare nel campo attraverso approcci molecolari, ma resta il fatto che il modello originale riporta le tappe, i tempi ed i modi di confronti[1]. Dobbiamo ringraziare il Prof. Riemschneider di questa collaborazione.
[1] Normal Table of Xenopus Laevis – Edizione 2015
Il modello era utilizzato dai Ricercatori a livello mondiale proprio perché era un modello di riferimento. Stessa genetica, stesso DNA, un piano alimentare di base studiato per mettere in risalto ogni piccola modifica positiva e/o negativa, con l’eliminazione delle variabili che potevano influenzare, in un senso o nell’altro il test. La dispositiva sintetizza i parametri del piano alimentare ed ambientale. Il piano alimentare ed ambientale prevedeva comunque di raggiungere l’obiettivo del DNA dello sviluppo dell’organismo, senza interferenze. Occorreva farlo per avere una base solida a cui affidarci per poter trasferire i risultati ad altri organismi quali ad esempio i mammiferi, i volatili, l’acquacoltura. Ancora oggi mi meraviglio quanto sento dei commenti relativi a questo test scientifico, che allora non veniva compreso, ma che non sia tenuto in considerazione nel nostro periodo mi rende molto perplesso in chi si permette delle critiche.
La diapositiva riporta le attività operative. Sino al 13° giorno gli organismi avevano le stesse condizioni. Dal 14° giorno si formavano i gruppi e si immetteva la sostanza per verificarne l’efficacia e la modalità dell’efficacia.
Il 36° giorno sarebbe avvenuta, come da modello, la misurazione. E poi si sarebbero confrontati i risultati. Il termine, per l’obiettivo del DNA dell’organismo poteva arrivare a 119 giorni. L’ottenimento dell’obiettivo del DNA era lo sviluppo da girino a rana, con tutto ciò che comportava questa trasformazione, nel bene o nel male.
Questa è la diapositiva del primo test. Il Prof. Riemschneider doveva verificare se vi era un effetto dose e doveva verificare anche un altro parametro. E qui ci si deve fermare per fare una osservazione. Liberate la mente. La genetica era uguale, i parametri ambientali erano uguali, i parametri alimentari erano uguali. Perché fece dei gruppi? Voleva verificare anche i parametri della sostanza. Per noi i soli parametri che interessavano erano quelli relativi alle cellule inattivate. Ma per il Ricercatore risultava importante verificare anche il parametro proprio della sostanza. Le cellule inattivate hanno un contenuto. Lo stesso contenuto lo avrebbe avuto il lievito morto, il lievito vivo, e le diverse frazioni delle cellule inattivate provenienti dalla nostra metodologia di fabbricazione. Sino al 14° giorno tutti i gruppi avevano avuto le stesse condizioni e quindi la partenza era uguale per tutti. Dal 14° al 36° giorno, passano 22 giorni. E le misurazioni evidenziano le variabili delle sostanze.
SOSTANZE | CARATTERISTICHE DELL’APPORTO |
Cellule inattivate tal quali | Cellule inattivate che conservano le caratteristiche della cellula del lievito |
Liquido cellule inattivate | La parte liquida è l’estratto di lievito usato nelle scatole Petri. |
Lievito morto | L’apporto è totale ma le cellule sono in toto o in gran parte rotte |
Lievito vivo | Le cellule apportano il tutto, sono vive ed hanno le loro caratteristiche |
E’ importante fare riferimento ai differenti dosaggi. Era il primo test ed il Prof. Riemschneider doveva avere delle indicazioni relative al dosaggio. Il Prof. Riemschneider fu impressionato dal risultato e mi chiamò per andare subito a Berlino. Voleva mostrarmi il risultato e quello che stava succedendo. Andai ma, francamente, non avevo capito molto. Restavo pur sempre uno zootecnico impressionato, positivamente, dalle dimensioni. Ed il Prof. Riemschneider mi ripeteva “Non si faccia impressionare dalle dimensioni. Rifletta. Qui succede qualcosa. Devo rifare un secondo test. Non dica ancora niente.”. Era convinto che la nostra metodologia producesse una fermentazione sessuale. Ma io continuavo a non capire.
Il test continuò e dal 51° giorno il gruppo delle cellule inattivate tal quale iniziò la prima metamorfosi, quindi la risposta dell’organismo, ed in 20 giorni tutti i componenti del gruppo completarono il loro sviluppo raggiungendo l’obiettivo: erano tutti rane. Mentre il gruppo controllo, come gli altri gruppi, iniziarono le metamorfosi dal 75° giorno ed impiegarono 40 giorni a raggiungere l’obiettivo del loro DNA, seppure con gli stessi parametri. Le domande erano molte e vengono riprodotte sulla diapositiva. Ma ancora non capivamo.
Si fece chiarezza con il secondo test. I dosaggi delle sostanze erano gli stessi, e vi era una variazione nei gruppi. Al posto della parte liquida venne effettuata la centrifugazione per ottenere solamente le cellule inattivate, senza la parte liquida. Ed avemmo la risposta. Il risultato era dovuto solamente alle cellule inattivate. Queste erano morte ma integre, quindi con le caratteristiche di termo, gastro, acido e antibiotico resistenza, tipiche delle cellule del lievito. Gli altri gruppi, seppure con lo stesso apporto delle sostanze, avevano delle caratteristiche che non permettevano all’organismo di usufruire per diverse ragioni del loro apporto. Il lievito morto non aveva cellule integre, il lievito vivo aveva le cellule vive ma era in competizione con le esigenze dell’organismo. Fermiamoci ed osserviamo le misure al 36° giorno per renderci conto che sono le cellule inattivate, e non la frazione liquida, costituita dall’intero apporto di ogni componente dell’estratto di lievito, ad ottenere il risultato da parte dell’organismo. E riflettiamo sullo sviluppo dell’organismo. Dal 51° al 71° giorno (20 giorni) il gruppo delle cellule inattivate raggiunge l’obiettivo. Gli altri gruppi iniziano dal 79° ed impiegano 40 giorni ad arrivare all’obiettivo.
L’evidenza era davanti a noi: la genetica era la stessa, le condizioni ambientali le stesse, l’alimento lo stesso, gli apporti gli stessi, l’unica variante era l’attività del microbiota, nel gruppo che ci interessava questa era maggiore rispetto al gruppo controllo. Anche questo arrivava ad obiettivo ma ci metteva molto più tempo sia come inizio che come rapidità di esecuzione della fase critica per arrivare ad obiettivo.
Ci rendiamo conto che eravamo su un altro continente, in piena era antibiotico centrica ci rendiamo conto della potenzialità dei simbionti!
Adesso ci fermiamo e dobbiamo o meno condividere le considerazioni sul test scientifico sperimentale. Il test in vivo è fondamentale. Perché ciò che vale per lo Xenopus vale per qualsiasi organismo. Ma quante sostanze che ci vengono proposte o vengono proposte al mercato hanno effettuato dei tesi in vivo con un modello sperimentale valido?
Il test ci dimostra che lo sviluppo dell’organismo è direttamente collegato alla attività del microbiota e viceversa. E qui dobbiamo andare ancora più in profondità. Ripercorrendo il test con quel poco che sappiamo oggi sul microbiota, il dr. Mauro Porta ed io, siamo arrivati ad una convinzione: le cellule inattivate innescano l’informazione nel microbiota, e la innescano da subito, all’entrata nell’organismo, che utilizza l’apporto (farina di ortiche) per ottenere il massimo, ma l’informazione passa all’organismo che la riceve e si mette, a sua volta, in moto, ed invia l’informazione dall’organismo al microbiota. La maggiore attività del microbiota corrisponde ad una maggiore attività dell’organismo. Ed è una corsa. Ma chiediamoci che cos’è che risulta indispensabile? Ognuno di noi oggi viaggia con il proprio telefonino per comunicare con altri che hanno anche loro un telefonino. Lo scambio delle informazione è automatico? Siamo certi che è automatico? Occorre un fattore determinante: il campo. Il campo è la maggiore attività del microbiota. Se non c’è campo, normalmente rappresentato da 5 tacche, o c’è ne è di meno, l’informazione non è possibile oppure ci vuole del tempo. E se il campo non è sincrono, l’informazione prende del gran tempo. Perché in 22 giorni, dal 14° al 36°, vi è quel risultato? Perché a parità di condizioni l’informazione corre dal microbiota all’organismo e viceversa? Perché le cellule inattivate hanno sincronizzato il campo. Perché l’ottenimento dell’obiettivo avviene in 20 giorni mentre negli altri gruppi inizia in ritardo ed avviene in 40 giorni? Perché non c’è sincronismo nel campo e l’informazione prende più tempo dal microbiota all’organismo e viceversa. Condividiamo? Qualcuno ha un’altra spiegazione? E quando diventa fondamentale il campo e la sincronia? La risposta è: nelle fasi critiche. Quando l’organismo ha la necessità di avere dei quid in più e li richiede al microbiota, e questo risponde perché ha campo. Condividiamo?
Se non vi è stata una convalida in vivo con dei test scientifici che annullano le variazioni dei parametri possiamo accettare l’esito di uno oppure 50 test? Valgono le considerazioni di Riemschneider relative alla funzionalità epatica dei vitelli. “Forse la genetica era differente, oppure i parametri erano differenti: temperatura, luce, stress, qualcosa d’altro. Il suo test vale solo per quel test ma non può valore per tutte le situazioni.”.
Ora passiamo ad un altro punto. Se una sostanza è stata testata con un valido test in vivo, possono valere ulteriori e diverse prove in Laboratorio, ma non il contrario. Le prove di Laboratorio non hanno valore se non per lo specifico test di Laboratorio, per fare affermazioni e/o insinuazioni che funzioni in vivo. Non è il nostro caso. Doxal prima ha eseguito un test scientifico in vivo, e poi ha continuato e continua a fare dei test di Laboratorio. Questo fa una differenza notevole. Condividiamo?
Ed ora veniamo alla bioattività. Per bioattività noi intendiamo la differenza tra la crescita di un simbionte da solo con la crescita dovuta ad una sostanza. Se la sostanza è inattiva come le cellule inattivate, prima si verifica che le cellule inattivate non crescono, mentre crescono le cellule del simbionte. Poi si uniscono e la differenza tra la crescita del simbionte senza le cellule inattivate e la crescita del simbionte da solo viene definita bioattività. Se le cellule non fossero inattive, ma crescessero, allora si dovrebbe fare la somma delle due crescite e verificare se vi è bioattività (maggiore crescita) oppure delle interferenze relativamente alla crescita del simbionte. E’ chiaro? E’ condivisibile?
La dispositiva allora diventa chiara.
Le determinazioni vengono illustrate con due metodologie.
..\certimeat 2017\Bioattività dimostrazione.docx scatole Petri
..\certimeat 2017\relazione floridi in word 2004.doc Nefelometria
Eravamo rimasti al fatto che avevamo ben capito il 2° test scientifico del Prof. Riemschneider. Chi lo aveva capito e bene è stato certamente il dr. Licinio Buratto.
Il dr. Licinio Buratto era Medico Veterinario, era il Direttore dell’Istituto Zooprofilattico del Veneto, Sezione di Treviso. Treviso era la provincia con la maggior densità di specie animali quali: polli da carne e da uova, tacchini, faraone, conigli, vitelli. Il dr. Buratto amava la propria attività, la squadra che collaborava con lui eseguiva > 100 antibiogrammi a settimana. Lui personalmente voleva conoscere degli allevamenti la genetica, le modalità di allevamento, gli attrezzi, gli spazi, l’aria, l’acqua, era impegnato in riunioni di informazione e formazione ai Veterinari, ai Tecnici ed agli allevatori del suo territorio. La collaborazione con me era focalizzato a due cose, per lui importanti: 1) ricevere campioni di antibiotici recenti o anche in dirittura di approvazione in qualsiasi parte del mondo, 2) ricevere delle “pastiglie” per singolo antibiotico o miscele con delle % da lui fissate, e questo era il compito di Grabitz. Il dr. Buratto aveva notato che in tutti gli allevamenti dove consigliava la somministrazione di cellule inattivate, liquide o adsorbite, poteva verificare una maggior resistenza alle malattie e ad una minor virulenza degli agenti patogeni. Le sue osservazioni erano correlate a delle cifre storiche delle malattie (una specie di primitivo foglio excel) e dei + che caratterizzavano l’ampiezza della risposta negli aloni delle colture.
Il dr. Buratto volle verificare con un test empirico la sua convinzione. La sua relazione è datata 15/5/1989. La prima considerazione che dobbiamo fare è di meravigliarci della passione e della curiosità scientifica del Tecnico che operava nel bel mezzo di un universo antibiotico centrico.
Leggiamo l’incipit: L’obiettivo del test è di verificare la “Capacità del Saccharomyces Cerevisiae di conservare e replicare il Lactobacillus acidophilus autoctono nel lume intestinale in polli da carne alimentati con mangime additivato di Thepax Dry”. Sottolineo la ricerca delle parole.
La conclusione: Thepax Dry, impiegato nella alimentazione dei volatili, è dotato di peculiare e spiccata attività biostimolante l’impianto, la conservazione e la replicazione di lattobacilli nel lume intestinale.
Aveva capito bene la prova in vivo? Io dico di sì.
Fa specie leggere, dopo il 2013, quando si è scoperto il microbiota, la sua entità, la sua importanza, che già nel 1989 il dr. Buratto indicava nelle cellule inattivate la capacità di stimolare la flora simbionte dell’allora sconosciuto microbiota. Pochi avrebbero oppure ancora oggi hanno la capacità tecnica e la curiosità professionale di gettarsi oltre.
..\certimeat 2017\Dossier THEPAX_Test biologico sperimentale inteso a verificare l-attivit’ del Thepax Dry nell-alimentazione del pollo da carne.pdf
Giorni | Cellule inattivate dry 50 gr/q.le | Controllo | Note | ||
| Duodeno | Ileo | Duodeno | Ileo |
|
0 schiusa | Alimento uguale. Prelievi: Duodeno a cm 10 valvola pilorica. Ileo a 15 cm valvole ileo cecali. N. Colonie * 1.000 |
| |||
14 | Trattamento metafilattico Otc 40 gr + Furalta 20 gr * hl acqua |
| |||
18 gruppi | Formazione Gruppi |
| |||
22 controllo | 6.000 | 0 | 0 | 0 | Tempo per promuovere impianto dei lattobacilli nella mucosa enterica |
26 controllo | 13.000 | 4.000 | 0 | 0 | |
41 controllo | 26.000 | 61.000 | 15.000 | 16.000 | > Insediamento |
51 controllo | 21.000 | 15.000 | 11.000 | 5.000 | > Insediamento |
59 | Trattamento metafilattico Otc 40 gr + Furalta 20 gr * hl acqua |
| |||
61 controllo | 3.000 | 27.000 | 1.000 | 16.000 | > Resistenza; controllo: abbattimento |
69 | Oxo+ Coli dosaggio terapeutico |
| |||
71 | 18.000 | 28.000 | 3.000 | 6.000 | > resistenza; controllo: abbattimento |
78 | 14.000 | 19.000 | 0 | 0 | > resistenza; controllo: abbattimento |
I pulcini sono stati suddivisi solo al 18 giorno. Il giorno 14 tutti i pulcini avevano ricevuto un trattamento metafilattico. I controlli del giorno 22 e, soprattutto 26, danno dei risultati molto interessanti. La quasi assenza di flora simbionte nel gruppo controllo è ritenuta dal dr. Buratto la conseguenza del trattamento metafilattico di quasi 10 giorni prima. La conferma la possiamo notare per il trattamento terapeutico del giorno 59 e di quello del giorno 69 e dei controlli dopo 10 giorni dal trattamento. Il dr. Buratto sottolinea la peculiare e spiccata attività biostimolante l’impianto ed il ripristino, conscio che qualsiasi trattamento provoca un danno ai patogeni ma anche danni collaterali per i simbionti. Da qui una risposta alle sue osservazioni che gli animali a cui venivano somministrate le cellule inattivate minori erano le malattie e minore la virulenza degli agenti patogeni. E siamo nel 1989! E il microbiota non è ancora stato individuato e/o pesato: i simbionti erano dei sacchetti in cui avvenivano, forse, delle reazioni enzimatiche!
In quel tempo le cellule inattivate, con la nostra metodologia, avevano attività l’interesse di molti Tecnici. Ognuno dei quali volle verificare la capacità di stimolare la crescita, da noi chiamata bioattività, su ceppi di cui conoscevano molto bene le caratteristiche, il modo di conservazione, le modalità per il risveglio e la cultura. Ma il test del dr. Buratto fece scalpore. Non tanto nel grande mercato, poiché era assolutamente antibiotico centrico e non dava alcuna importanza alla flora simbionte, ma al ristretto numero di tecnico, anche loro antibiotico centrici ma aperti di mente, che si era unito intorno a noi. Oltre al Prof. Riemschneider ed al Prof. Cirilli, avevamo destato l’interesse di Tecnici dell’Institut Pasteur. Il padre di Jacques era il Direttore del Dipartimento delle Malattie Tropicali presso l’Institut Pasteur.
La lettera del dr. Buratto fece scalpore su questo tavolo. “Ma cosa intende dire? Sembra quasi che le cellule inattivate stimolino solamente la flora simbionte e non la flora patogena e/o commensale! Se le cellule inattivate hanno una attività biostimolante la devono avere nei confronti di tutte le specie presenti nel lume intestinale.”. “Il test del dr. Buratto è empirico ed anche primitivo, prende dei polli e poi li sacrifica per fare le conte senza identificare le specie e senza sapere il numero delle specie di partenza. Noi possiamo verificare le sue affermazioni con un test scientifico.”.
Fu così che il Prof. J.F. Guillot si prese l’incarico di verificare, all’Università di Tours la tesi del dr. Buratto.
..\certimeat 2017\Dossier THEPAX_Rapport sur etude experimentale de l’effet du LC-S1 sur la microflore digestive du poulet gnotoxenique.pdf
Leggiamo il titolo. Teniamo presente che la sigla LC-SI sta per cellule inattivate.
Rechercher si l’administration du LC-Sl en continu dans l’aliment du poulet modifie quantitativement les populations des espèces microbiennes présentes dans le tube digestif du poulet hébergeant une microflore gnotoxénique.
Lo scopo è: ricercare se la somministrazione di LC (cellule inattivate) nell’alimento per polli modifica quantitativamente les popolazioni delle specie microbiche presenti nel tubo digestivo del pollo che ospita una microflora gnotoxenica. [gnotoxenico = conosciuto].
Nel titolo vi è la dubitativa “se”, si intende verificare se la somministrazione produce un aumento delle specie presenti e conosciute.
Pour les E.Coli la population varie entre 1,7 x 106 et 1,39 x 108 par g. La différence entre lots traités et témoin est faible avec des valeurs légèrement supérieures pour les lots traités.
Pour les streptocoques fécaux la population varie entre 1,06 x 106 et 2,33 x 108 par g. Les valeurs obtenues fluctuent mais aucune différence nette ne peut être mise en évidence entre les trois lots.
Pour les lactobacilles la population varie de 1,88 x 106 à 2,4 x 109 par g. Les lots traités ont des titres plus élevés, notamment pendant les 3-4 premières semaines, avec, semble-t-il, un effet lié à la dose administrée.
I Lattobacilli, i simbionti, crescono di un log! Rileggendo il lavoro oggi avremmo proposto delle proporzioni differenti tra i simbionti (> 90%) rispetto ai commensali e patogeni (< 2%), condividete?
Les tailles des populations microbiennes de la flore aviaire gnotoxénique sont conformes aux données de la littérature. L’administration de la levure LC-S1 ne modifie pas la population de streptocoques fécaux mais semble influer légèrement sur la population colibacillaire et plus nettement sur la population lactobacillaire qui est supérieure dans les lots traités avec une augmentation dépendant de la dose de levure administrée. Bien que les différences obtenues ne soient pas statistiquement significatives, cette tendance constante à élever les populations lactobacillaires observée dès le début et pendant presque toute la durée de l’expérience est en accord avec les résultats de L. BURRATO et peut-être à approfondir.
Questo lavoro ha costituito un vero e proprio scoppio! Le cellule inattivate favoriscono la crescita, il mantenimento e il ripristino dei simbionti. Il nostro tavolo di lavoro raggruppava i Tecnici dell’Istituto Pasteur, Riemschneider, Jacques, Grabitz ed io.
La domanda che uscì fu: “ma cosa in effetti funziona?”. Noi di Doxal non eravamo così perplessi, ma per i Tecnici di Pasteur sembrava che questo fosse una cosa davvero importante.
Ci dissero: Lasciateci lavorare e noi lo scopriamo.
..\certimeat 2017\ENSBANA DOSSIER THEPAX.pdf
Il lavoro è stato eseguito prendendo in esame dei ceppi di simbionti che non erano in grado di utilizzare, per le loro caratteristiche, le vitamine oppure gli aminoacidi, oppure le purine, oppure le tre classi di componenti insieme.
Le cellule inattivate sono state esaminate per i loro particolari apporti in vitamine, aminoacidi, purine, e confrontate con l’estratto di lievito farmaceutico che è stato utilizzato come riferimento.
I risultati hanno dimostrato, in particolare, un marcato risultato relativamente ai ceppi che non erano in grado di utilizzare le purine, come dimostra il grafico. Andiamo ad osservare i tempi che arrivano sino a 32 ore. Il fatto che i risultati con le cellule inattivate, in Laboratorio, si notino dopo le 8 – 12 ore viene indicato come periodo necessario per rompere la cellula inattivata, da parte del simbionte di riferimento, mentre, per l’estratto di lievito farmaceutico liofilizzato, sempre in Laboratorio, questo è immediatamente disponibile.
Risultati minori si sono riscontrati per quanto riguarda i simbionti che non erano in grado di usufruire delle vitamine e degli aminoacidi, anche se i risultati erano davvero confortanti. Lo possiamo notare nella tabella riassuntiva a pagina 15. I segni ++ danno delle indicazioni di massima.
La frase che voglio sottolineare è la constatazione dei Tecnici relativamente alle prove di Laboratorio ed alle prove in vivo. Anche questi Tecnici avevano condiviso l’importanza del test scientifico in vivo, e del modello scelto.
Una loro constatazione è la seguente:
Le fait que l’ajout de l’extrait de levure dans le milieu témoin négatif (MS2-B) donne un meilleur taux de croissance que dans les milieux témoins négatifs supplémentés par LCSI n’est probablement important qu’in-vitro. En effet les milieux supplémentés par LCS1 permettent d’avoir des biomasses importantes et des croissances plus étalées dans le temps pouvant avoir un effet bénéfique in-vivo.
I Tecnici dell’Institut Pasteur erano persuasi di essere sulla strada giusta. “Per noi la sostanza è nella frazione purinica. Dateci il tempo per individuarla.”. Il mio ragionamento fu: abbiamo a disposizione un alimento, che non ha bisogno di alcuna registrazione. Sappiamo che funziona in vivo anche se dobbiamo chiarire i dosaggi e imparare a gestire la bioattività. Non credo che Doxal abbia un interesse nell’individuare la sostanza, questo mi ricordava troppo da vicino la mentalità antibiotico centrica, il bisogno della sostanza. Se l’obiettivo fosse stato raggiunto non sarebbe stato alla portata di Doxal arrivare alla registrazione.
Decisivo fu anche il parere, sempre intorno al tavolo, del Prof. Riemschneider. Non ricordo le parole esatte, ma i concetti quelli si: Questi cinque o sei ceppi hanno delle caratteristiche, ma se ci sono significa che per l’intera flora batterica sono e restano importanti anche se non sanno utilizzare le vitamine, oppure gli aminoacidi, oppure le purine, oppure i tre insieme. Significa che altri lo faranno per loro, ma non sappiamo che cosa di fondamentale anche questi cinque o sei ceppi fanno e che è, visto che ci sono, essenziale per l’organismo. Veneroni, non divida mai la cellula inattivata. Condivisi la visione del Prof. Riemschneider e qualche altro Tecnico approvò.
Fu una tappa del viaggio.
Ora dobbiamo fare un passo indietro. Immediatamente dopo il test scientifico in vivo del Prof. Riemschneider (era il 1983) inutile dire che in una ristretta cerchia di Tecnici, di alto profilo, si infittirono i lavori di Laboratorio. Le determinazioni di Laboratorio hanno un senso solo dopo il test in vivo, altrimenti restano un semplice test di Laboratorio che dimostra una crescita, ma non esiste la prova che vi sia l’effetto sull’organismo. La crescita solo in Laboratorio non significa che ritroveremo lo stesso risultato benefico sull’organismo, se non vi è un serio test su di un modello in vivo.
I lavori vennero eseguiti dal Prof. Cirilli che espose i propri risultati in una riunione. Il Prof. Cirilli dimostrò che la bioattività non veniva inficiata, ad esempio dalla temperatura.
La diapositiva mostra i risultati di Laboratorio ottenuti dal Prof. Cirilli dalle cellule inattivate nella forma liquida e nella forma spray dry (togliendo quindi il liquido). La differenza tra la crescita dei Lattobacilli tal quali viene confrontata con la crescita ottenuta con le cellule inattivate, nelle due forme, sottoposta a diverse temperature ed a diversi tempi.
Questi risultati furono riconosciuti come validi proprio perché vi era stata la convalida, prima, del test in vivo.
Diversi Tecnici vollero provare con i ceppi di simbionti di cui conoscevano i metodi di conservazione, risveglio. Ogni Tecnico ha dei propri ceppi che conosce molto bene e ritiene che le prove debbano essere eseguite da lui stesso e/o dal proprio gruppo.
I lavori vennero eseguito su un alto numero di Lattobacilli e Bifidobatteri, nella diapositiva vengono riportati solamente alcuni dei grafici che ci sono stati inviati anche per conoscenza.
L’unico Tecnico che svolse un particolare lavoro su il Prof. Allen che volle incontrarmi in Inghilterra proprio per dirmi.” Ho assistito con interesse ai lavori presentati dal Prof. Cirilli, e ho visto la prova in vivo. Non sono d’accordo con i risultati proposti dal Prof. Cirilli e dagli altri Tecnici. Personalmente lavoro con un batterio di cui conosco vita e miracoli, ho eseguito le determinazioni di Laboratorio nelle 24 ore prelevando ogni 2 ore i batteri che erano vivi. La bioattività è superiore di dieci volte. Mi piacerebbe lavorarci perché non ho visto un risultato così brillante. Ma sono occupato in altre ricerche altrimenti avrei proposto alla mia Società di poterci lavorare.”. Questo è tutto. Fui accompagnato, nella visita ai Laboratori del Prof. Allen in Inghilterra da Bart Wijga.
..\certimeat 2017\ALLEN Thepax in vitro Microbiological Studies.pdf
Non capivo e non capisco molto di microbiologia. Feci presente che al di là dei lavori dei differenti Tecnici ed anche del suo lavoro, Doxal utilizzava un ceppo di simbionte, normalmente presente nel microbiota che mi aveva donato il Prof. Matteuzzi dell’Università di Bologna. Questo ceppo ha la caratteristica di un periodo di latenza di poche ore (5-6 ore) il che ci permetteva di eseguire un controllo delle nostre produzioni. In pratica si fabbrica al mattino e durante la giornata lavorativa si possono eseguire le determinazioni per la liberazione di ogni lotto di produzione. Le attività operative riguardano: 1) Le cellule sono inattivate (sono morte), 2) vi è una bioattività > 2.5 nei confronti di questo ceppo di Lattobacillo. Questa operatività è valida ancora oggi.
Dopo di ciò vi è l’attività svolta in campo per le diverse specie animali, nelle diverse fasi, e nei differenti Paesi e/o situazioni.
Il tutto è stato e viene svolto da Tecnici che possono fornire tutti i dettagli.
Nelle diapositive ho riportato i nominativi dei Tecnici, ed alcune frasi riprese in particolare dalla pubblicazione di Jean Pierre Henry che invito a leggere e rileggere.
Mi soffermo su un particolare: la somministrazione di probiotici per arricchire il microbiota.
Rimando alla riflessione: ..\certimeat 2018\eubiosi\Rivisitazione cellule inattivate di saccharomyces cerevisiae.docx
Leggiamo insieme alcuni. Assolutamente niente in contrario alla somministrazione di simbionti, anzi, in particolare per determinati fasi dello sviluppo embrionale. Il suggerimento è sempre quello di facilitare l’impianto dei nuovi simbionti.
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